Institut für Virologie, Justus-Liebig-Universität Gießen

Arbeitsgruppe Rümenapf

Leitung

Prof. Dr. Till Rümenapf

Mitarbeiter

  • Manuela Heimann
  • Dr. Thomas Krey
  • Benjamin Lamp
  • Christina Riedel
  • Jessica Schneider
  • Jessica Roman Sosa
  • Dr. Gleyder Roman Sosa

Arbeitsgebiete

Rolle des Nichtstrukturproteins 3 (NS3) und des Coreproteins (C) in der Morphogenese von Pestiviren

Das Viruspartikel von Pestiviren besteht aus der genomischen RNA und vier Proteinen, den drei Hüllglykoproteinen Erns, E1 und E2 und dem kleinen Core-Protein. Von letzterem wird angenommen, dass es zusammen mit der genomischen RNA das Nukleokapsid bildet. Wir haben die Biosynthese dieses Proteins untersucht und dabei einen komplizierten Reifungsweg identifiziert, der Aktivitäten von einer viralen (Npro) und zwei zellulären Proteinasen (Signalpeptidase, Signalpeptidpeptidase) beinhaltet. Die Prozessierungen des pestiviralen Core-Proteins und des Core-Proteins vom Hepatitis C Virus (HCV) sind insgesamt sehr ähnlich. Bei Untersuchungen zur C-terminalen Prozessierung vom Core-Protein des Virus der klassischen Schweinepest (KSPV) wurden überraschenderweise Mutationen in einem Nichtstrukturproteingen identifiziert, die ein für die Bildung von infektiösen Virionen defektes Core-Protein effektiv kompensieren können. Somit weisen unsere Daten auf eine unerwartete Beteiligung eines Nichtstrukturproteins bei der Virusmorphogenese hin. Das TP B13 stellt sich zur Aufgabe, die Bedeutung des Nichtstrukturproteins sowie die Funktion(en) des Core-Proteins für die Bildung von infektiösen Pestiviruspartikeln zu bestimmen.

Internalisierung und Membranfusion von BVDV

Mit der Identifizierung von bovinem CD46 als zellulärem Rezeptor sowie dem Nachweis der endosomalen Internalisierung konnten wir grundsätzliche Aspekte der Aufnahme des Pestivirus BVDV (Bovines Virusdiarrhöe Virus) in die Zielzelle aufklären. Dabei scheint das Virus auf den ersten Blick bewährte Rezeptorstrukturen (CD46) und Mechanismen (Clathrin-abhängige Endozytose gefolgt von pH abhängiger Fusion) zu verwenden, wie sie bereits von einer Reihe behüllter RNA Viren bekannt sind. Bei näherer Betrachtung zeigt sich jedoch, dass die Infektion der Wirtszelle komplexer ist, als es die scheinbare Analogie zu verwandten Viren (Flaviviridae) vermuten lässt. So muss davon ausgegangen werden, dass die Bindung an CD46 alleine nicht für die Infektion ausreicht. Mindestens ein weiteres Molekül, wahrscheinlich ein Korezeptor, ist für die Internalisierung von BVDV erforderlich. Dies ist bemerkenswert, da CD46 ebenfalls Clathrin-abhängig von der Plasmamembran internalisiert wird, also den gleichen Internalisierungsmechanismus benutzt wie das gebundene Virion. BVDV gelangt jedoch nicht als an CD46 gebundener Ligand in die Zelle. Im geplanten Teilprojekt soll insbesondere der Internalisierungsdefekt von BVDV resistenten bovinen Zellen (CRIB Zellen) durch genetische und biochemische Methoden aufgeklärt werden. Im Vordergrund steht dabei das Ziel, die in CRIB Zellen fehlende Funktion durch retroviralen Gentransfer einer cDNA Bank aus MDBK Zellen zu komplementieren. Zum anderen sollen Ergebnisse experimentell verifiziert werden, die eine Interaktion des viralen Glykoproteins E2 nicht nur mit CD46, sondern auch mit dem Corezeptor nahelegen.

Der Analyse des Glykoproteins E2 und des E1E2 Komplexes ist der zweite Themenkomplex des Teilprojekts gewidmet, da E2 neben der Rezeptorbindung vermutlich auch für die Membranfusion verantwortlich ist. Auch hierbei gibt es wichtige Unterschiede zum Flavivirusmodell, denn BVDV ist nicht unmittelbar zur pH abhängigen Fusion fähig. Vielmehr bedarf es eines Aktivierungsschrittes, der BVDV während der Internalisierung als Voraussetzung für die pH abhängige Fusion in einen metastabilen Zustand überführt. Hierbei spielen intra- und intermolekulare Disulfidbrücken zwischen E1 und E2 eine besondere Rolle. Um die verschiedenen Funktionen von E2 und E1E2 besser zu verstehen, soll als übergeordnetes Ziel die dreidimensionale Struktur von E2 bestimmt werden. Unterstützend für die geplante Modellierung des E2 sind verschiedene biochemische Analysen vorgesehen, u.a. Kartierung der Disulfidbrücken, Lokalisierung des Fusionpeptids und Lokalisierung der Rezeptorbindungstelle im E2. Darüber hinaus sind Ansätze zur Kristallisierung und Analyse der Röntgenkristallstruktur von E2 geplant. Insgesamt erwarten wir uns wichtige Fortschritte in der vollständigen Aufklärung des Invasionmechansimus von Pestiviren, was sowohl Rückschlüsse auf die Pathogenese der veterinärmedizinisch wichtigen Infektionskrankheiten "Klassische Schweinepest" und "Bovine Virusdiarrhöe" zuläßt, als auch modellhaften Charakter für andere Mitglieder der Virusfamilie Flaviviridae (inbesondere Hepatitis C Virus) haben kann.

Drittmittelförderung

Sonderforschungsbereich 535, Teilprojekt B13, Rolle des Nichtstrukturproteins 3 (NS3) und des Coreproteins (C) in der Morphogenese von Pestiviren und Teilprojekt A18, Internalisierung und Membranfusion von BVDV


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